PLATAFORMA BIOINFORMÀTICA

Real-time RT-PCR: Càlcul de l'efficiència

Eficiència de la Real-time RT-PCR

De forma general, la PCR consisteix en quatre etapes diferents, similars a la cinètica de creixement bacterià observada per Monod. En la segona etapa de la cinètica de Monod té lloc la fase logarítmica, equivalent al creixement exponencial del producte de la PCR --idealment la D.O. del producte de PCR es dobla en cada cicle-- mesurat com a senyal de fluorescència. La cinètica de la PCR en aquesta fase pot descriures com: R_n=R₀·(1+E)ⁿ amb R_n i R₀ com la quantitat inicial del senyal de fluorescència després de 0 o n cicles respectivament, i E com a eficiència.
D'aquesta manera, el càlcul de l'eficiència per un gen específic s'obté de: Eff=10^slope.
S'ha descrit en la literatura com l'ús, per defecte, de valors d'eficiència de 2 (100% de l'eficiència de la PCR) afecta significativament al càlcul acurat dels nivells d'expressió relatius a un gen específic; observant fins a un error de 4-fold quan l'eficiència varia tant sols en un rang de 0,04.
Per calcular l'eficiència de cada gen, l'eina C_T utilitza les dades de fluorescència mesurades per cada cicle al llarg de tot el procés d'amplificació. L'algoritme implementat pel càlcul de l'eficiència es basa en el programa LinRegPCR.
Concretament, el procés per obtenir l'eficiència consisteix en linearitzar les dades de la fase exponencial de la PCR i determinar la millor regressió lineal. Aquest procés es dur a terme per cada un dels gens i cada mostra, obtenint un resultat específic per cada cas. Els valors finals d'eficiència per gen són el resultat de la mitja dels diferents valors de cada gen.

En les dos figures que es mostren a la dreta es representa el funcionament del programa per obtenir el valor de l'eficiència.
Es pot observar com les dades inicials (fluorescence vs cycle number) són linearitzades (log(fluorescence) vs cycle number) i com a partir d'aquestes s'obté la recta de regressió lineal òptima (a partir dels punts de color negre).
El pendent resultant de la recta (0.261) ens permet calcular l'eficiència mitjançant Eff=10^slope; obtenint Eff= 1,825.

Problemes-Sugerències: [email protected] / [email protected]