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Real-time RT-PCR: Cálculo de la eficiencia

Eficiencia de la Real-time RT-PCR

De forma general, la PCR se basa en cuatro etapas diferentes, similares a la cinética de crecimiento bacteriano observada por Monod. En la segunda etapa de la cinética de Monod tiene lugar la fase logarítmica, equivalente al crecimiento exponencial del producto de la PCR --idealment la D.O. del producto de PCR se dobla en cada ciclo-- mesurado como señal de fluorescencia. La cinética de la PCR en esta fase puede descrivirse como: R_n=R₀·(1+E)ⁿ con R_n y R₀ como la cantidad inicial de señal de fluorescencia despues de 0 o n ciclos respectivament, y E como eficiencia.
Así, el cálculo de la eficiencia para un gen específico se obtiene de: Eff=10^slope.
Está descrito en la literatura como el uso, por defecto, de valores de eficiencia de 2 (100% de l'eficiencia de la PCR) afectan significativamente al cálculo acurado de los niveles de expressión relativos a un gen específico; observando hasta a un error de 4-fold cuando la eficiencia varia tan solo en un rango de 0,04.
Para calcular la eficiencia de cada gen, la herramient C_T utiliza los datos de fluorescencia mesurados para cada ciclo a lo largo de todo el proceso de amplificación. El algoritmo implementado para el cálculo de la eficiencia se basa en el programa LinRegPCR.
Concretamente, el proceso para obtener la eficiencia consiste en linearizar los dados de la fase exponencial de la PCR y determinar la mejor regresión lineal. Este proceso se lleva a cabo para cada uno de los genes y cada muestra, obteniendo un resultado específico para cada caso. Los valores finales de eficiencia para cada gen son el resultado de la media de los diferentes valores de cada gen.

En las dos figuras que se muestran a la derecha se representa el funcionamiento del programa para obtener el valor de la eficiencia.
Se puede observar como los datos iniciales (fluorescence vs cycle number) son linearizados (log(fluorescence) vs cycle number) y como a partir de estos se obtiene la recta de regresión lineal óptima (a partir de los puntos de color negro).
La pendiente de la recta (0.261) nos permite calcular la eficiencia mediante Eff=10^slope; obteniendo Eff= 1,825.

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